DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh por PCR

DETERMINACION DEL FACTOR RH POR PCR

OBJETIVO

El objetivo de esta practica es introducir a los estudiantes en los principios y practica de la PCR, mediante el estudio del RH , mediante la tecnica de la PCR.

MATERIALES Y REACTIVOS.

• Tampon de electroforesis concentrado 10x
• Agarosa
• Mix pcr
• Control positivo rh
• Muestra de adn ( saliva )
• Micropipetas
• Puntas de pipeta con filtro

EQUIPOS

• Termociclador
• Microondas
• Cubeta de electroforesis
• Peso

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar deberemos extraer el ADN de una muestra de saliva. En nuestro caso tenemos las muestras congeladas a -80C, por lo que sólo tendremos que sacarlas, descongelarla y homogeneizar

2. Utilizamos 2,5 l (100-250 ng) del ADN de cada alumno para cada reacción de PCR.

 a) Preparar un control negativo de amplificación, para ello colocar 2,5 l de agua libre de nucleasas en  lugar del ADN, esto sirve para saber si los reactivos o micropipetas y puntas pueden estar contaminados con ADN.

 En el control negativo no se ha de amplificar nada. 

b.- preparamos un control positivo de amplificacion

para ellos preparamos 2,5 ul de contro, positivo rh, en lugar del adn.

mix pcr 22,50 ul de adn,( 100-250ng ), 2,5 ul, volumen total de 25ul

3.- mezclamos bien los componentes

4.-Realizacion del proceso de amplificacion

IMPORTANTE: Para la activación de la Polimerasa “HOT STAR” es necesario programar un paso de desnaturalización inicial de 10 minutos a 95oC, después programar los 30 o 40 ciclos específicos de cada producto a amplificar.

PROGRAMA Rh 

PASO TEMPERATURA TIEMPO

Desnaturalización HOT STAR 95oC -10 minutos 

Ciclos PCR Realizar 35 ciclos 

95oC- 30 segundos, 64oC -30 segundos,72oC- 45 segundos

Extensión final 72oC -10 minutos 

5.- el producto de la pcr , se debe de sembrar en un gel de agarosa

RESULTADOS Y OBSERVACIONES

• 
  

  Hueco Bethoven Hueco Muestras Hueco Positivo Negativo

Esta era la disposicion de los pocillos,pudimos observar que hubo smear, y segun nosotros una pequeña reaccion del adn, aunque pensamos que fue eso " segun nosotros ".

ERRORES Y FALLOS

Uno importante es que utilizamos un peine distinto al de siempre y los pocillos fueron muy pequeños, no lo tuvimos en cuenta y algo de muestra se esparcio por el tampon.

creemos que la tecnica en si se realizo bien, se puso todo el cuidado del mundo en el proceso de la mezcla de los componentes.

Decir las condiciones de la sala de limpio aunque intentamos en toda la maxima medida , no son condiciones de esterilidad , no esta preparada para tal fin.

CONCLUSION

Para nosotros fue positiva ya que el objetivo de la practica era el de realizar una pcr , y ese objetivo se cumplio con creces ya que preparamos el termociclador, se limpio y esterilizo la sala de limpio , se preparo todo el material necesario, se hizo el gel  para la electroforesis y como he dicho antes el concepto que era el de la utilizacion , mezcla y preparacion de los componentes se hizo lde la manera que en ese momento mejor consuderamos , siguiendo el protocolo y siendo meticulosos.