PREPARACIÓN DE GELES DE AGAROSA

PREPARACIÓN DE GELES DE AGAROSA

OBJETIVO

El objetivo de este experimento consiste en desarrollar una comprensión básica de la teoría de la electroforesis y en adquirir práctica con los procesos de separación de diversas moléculas a través de la electroforesis horizontal sobre gel.

FUNDAMENTO 
La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación especialmente efi caz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas.

A pesar de que la electroforesis en gel de agarosa sea una técnica simple y fácil, posee dotes de separación efi - caces. El gel se fabrica disolviendo polvo de agarosa en una solución tampón hirviente. A continuación, se deja enfriar la solución a 55°C y se vierte en un soporte, donde se solidifi ca. Se sumerge después el soporte en un equipo de electroforesis de electrodos que contiene solución tampón.

Para preparar las muestras para la electroforesis, éstas se mezclan con componentes que les agregan densidad, como el glicerol o la sacarosa. Estos proporcionan a las muestras más densidad que la del tampón de electroforesis. Las muestras pueden entonces colocarse por medio de una micropipeta o pipeta de transferencia en las rendijas visibles en el gel con la ayuda de una plantilla. Por su densidad, las muestras se sumergen en la solución tampón y permanecen en los pocillos.

El equipo de electroforesis se conecta a una fuente de corriente continua directa y se somete a tensión. Las moléculas cargadas contenidas en las muestras penetran en los capilares del gel. Las moléculas de carga neta negativa migran hacia el electrodo positivo del aparato de electroforesis (ánodo), mientras que las moléculas de carga neta positiva migran hacia el electrodo negativo (cátodo).

 Dentro de ciertos márgenes, cuanto más fuerte sea el campo eléctrico, mas rápido migran las moléculas. El tampón sirve a la vez para conducir la electricidad y para controlar el pH. Efectivamente, el pH tiene una infl uencia sobre la carga y la estabilidad de las moléculas biológicas


PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UN GEL AL  1%

1. Materiales
 -Pipetas de 2-20uL y de 20-200uL
-Cámara de electroforesis horizontal
 -Peines para las bandejas -Bandeja para la preparación del gel
 -Fuente de poder
 -Probetas de 50mL, 100mL y 1000mL
 -Botella de vidrio con más de dos veces el volumen de la solución de agarosa a preparar.
 -Guantes de látex -Guantes para calor

2. Reactivos
 -Syber safe
-Agarosa grado molecular
 -TBE 10X -Agua Destilada






3. Preparación de soluciones

1% de GEL------------- 0,5 gr agarosa, 30 ml  de buffer 1x

4. Protocolo de preparación de un gel de agarosa al 1%



1. Prepare la bandeja sellando los bordes por presión o con cinta adhesiva (esto depende del modelo de cámara utilizado) y póngale los peines.

2. Pesamos  0,5gr. de agarosa.

3. Coloque la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 30 mL de buffer TBE 1 X y caliente en el microondas sobre minuto y medio,  o en el baño de María hasta su completa disolución.

 4. Cuando la solución de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la mano, agregue  5uL de SYBR Green .

5. Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la solución.

6. Sirva la solución en la bandeja de corrida vertiendo la solución lentamente por uno de los extremos de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el área de corrida de las muestras con una punta limpia.

 7. Deje polimerizar la agarosa

8. Para la corrida, llene el tanque de la cámara de electroforesis con buffer TBE 1 X hasta cubrir el gel.

 9. Conecte los electrodos de la cámara a la fuente de poder, gradúe el voltaje deseado y corra las muestras.

6. PREGUNTAS Y RESPUESTAS SOBRE LA PRÁCTICA

 Una serie de preguntas se pueden realizar a los alumnos sobre la práctica: 

1. ¿En base a qué la electroforesis de agarosa separa moléculas? 

La electroforesis separa las moléculas en base a su tamaño, carga y forma. 

2. Explicar la migración de acuerdo con la carga.

Las moléculas que tienen una carga negativa migraran hacia el polo positivo; mientras que las moléculas cargadas positivamente migrarán hacia el polo negativo. 

3. ¿Qué conclusión se puede sacar del experimento realizado? 

Todos los colorantes tiene carga negativa. La electroforesis es capaz de separar la mezcla de colorantes según su carga. El color observado en el gel es el real del colorante. 

4. ¿Qué sucedería si se utilizará agua destilada en lugar del Tampón de electroforesis en la cámara de electroforesis o en la solución del gel de agarosa?

Como el agua destilada no contiene iones esto reducirá la conductividad del fluido y la movilidad de las moléculas a migrar en el gel. 

El tampón sirve como conductor de la electricidad y controla el pH, lo cual es importante para la estabilidad de las moléculas biológicas. 

5. ¿El ADN hacia qué electrodo migrará? 

Como el ADN tiene una carga negativa a pH neutro migrará a través del gel hacia el electrodo positivo durante la electroforesis.

CONCLUSION

Hemos a preparar un gel de agarosa y su fundamento para su utiizacion en la pcr, a la misma vez nos hemos familiarizado con las camaras de electroforesis, en nuestro caso hemos utilizado una de las grandes, teniendo en cuenta esto , hemos utilizado otras medidas a la hora de preparar el tampon de electroforesis, tambien emos preparado un gel de agarosa con otras medidas diferentes a los compañeros , lo hemos hecho lo mas fino posible para ver si el ADN migra hacia el positivo correctamente.