DANAGENE SPIN BLOOD DNA KIT

DANAGENE SPIN BLOOD DNA KIT

1. INTRODUCCION 

Este kit está designado para una rápida extracción y purificación de ADN genómico de alta calidad a partir de sangre total, suero, plasma y fluidos biológicos utilizando Spin columnas con membrana de silica que une selectivamente el ADN

 Este Kit utiliza un nuevo Tampón de Lisis / Unión formulado específicamente para la extracción de ADN a partir demuestras de sangre para la obtención de un alto rendimiento. 

Características: 

 Para una rápida obtención de ADN de elevada calidad y listo para su uso a partir de sangre. 

 Tamaño de muestra: 300 microlitros de sangre total, plasma, suero y fluidos biológicos.

 No se utilizan extracciones orgánicas o precipitaciones con alcohol. 

 Completa eliminación de inhibidores o contaminantes. 

 Típico rendimiento: 6- 9 micrg ADN genómico. 

Volumen de elución: 50-200 microlitros. 

Se obtiene un ADN de elevada calidad que puede ser utilizado directamente en PCR,

 Southern, clonaje y en cualquier reacción enzimática.

Aplicaciones: 

Extracciones de ADN genómico, viral y bacteriano. 

 ADN a partir de sangre total (sangre humana o animal, fresca o congelada). 

 ADN a partir de sangre tratada con citrato, EDTA o heparina. 

ADN a partir de suero, plasma, plaquetas, “buffy coat”, fluidos biológicos y “dried blood spots

Procedimiento:

En el caso muestras de sangre y si se requiere el ADN genómico, la mejor opción es una lisis previa y selectiva de los eritrocitos con el Tampón Lisis RBC para procesar sólo los linfocitos que nos proporcionará mejores resultados en cuanto calidad y rendimiento. 

Si se está buscando otro tipo de ADN (bacteriano, vírico) la lisis se consigue mediante la incubación de la sangre total en una solución caotrópica en presencia de proteinasa K a 70ºC.

 Se crearán las condiciones apropiadas para que el ADN se una a la membrana de fibra de sílica al añadir etanol al lisado.

Los contaminantes son eliminados por 2 diferentes lavados y finalmente el ADN es eluido con un tampón de elución.

2. COMPONENTES KIT

Equipos y reactivos necesarios y no provistos 

 Isopropanol. 

 Etanol 100 % 

 Microcentrifuga. 

 Microtubos de 1,5 ml.

El pretratamiento más habitual en muestras de sangre consiste en:

1. La lisis de los hematíes. Consiste en romper los hematíes con una solución o tampón de lisis en la proporción 1:3, es decir, un volumen de sangre por tres volúmenes de solución de lisis. Actualmente hay muchas soluciones de lisis comerciales, la mayoría de ellas basadas en fenómenos osmóticos y/o en detergentes suaves.


Reactivos comerciales para la lisis de los hematíes

Solución de lisis de eritrocitos estándar (ósmosis).

 Cloruro de amonio (NH4CI): 150 mM.
 Bicarbonato potásico (KHCO3); 10 mM.
EDTA: 1 mM.

Solución de lisis de eritrocitos con detergente. ( pretratamiento )

Tris-HCI: 10 mM, pH 8.

 TritonX-100: 1%.

Sacarosa: 11 %.

Solucion de lisis celular ( extraccion ) con proteinasa K,


Tris-HCI: 10 mM, pH 8.
 NaCI: 400 mM.
EOTA: 2 Mm. 50S: 2%.
Proteinasa K: 0,5 mg/ml.

2. Centrifugado de la muestra. Una vez producida la lisis de los hematíes, se centrifuga la muestra y se obtiene un sedimento o pellet y un sobrenadante.

 3. Eliminación del sobrenadante. Consiste en eliminar la fracción líquida sobrenadante con una pipeta pasteur. Con esto se eliminarán los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina, liberada por la rotura de los hematíes

 4. Conservación del sedimento. Entonces continuaremos el proceso de extracción de los ácidos nucleicos. En el sedimento habrán quedado los leucocitos.

 Almacenamiento y estabilidad 

Todos los componentes son estables durante 12 meses desde la fecha de la compra siendo almacenados como se indica.

 ATENCION: 

El Tampón de Lisis/Unión y el Tampón de Desinhibición contiene guanidine hydrochloride que es irritante, utilizar guantes y gafas.

3. PROTOCOLO 

3.1 Recolección y almacenamiento de muestras 

.Muestras de sangre total, deberían ser conservadas a 4ºC inmediatamente después de su recolección. Son estables durante semanas a 4ºC. También pueden ser enviadas en contenedores refrigerados. 

Muestras de plasma y suero, deberían ser enfriadas y centrifugadas inmediatamente en la hora siguiente a su obtención.

 Para la preparación de suero sanguíneo centrifugar a 3.000 rpm durante 10 minutos y para muestras de plasma centrifugar a 3500 rpm durante 15 minutos.

 Las muestras de plasma deberían ser separadas de las células y pasadas a un nuevo microtubo de 1,5 ml, la capa intermedia que incluye las células blancas, plaquetas, no debe ser transferida con el plasma.

 Las muestras de suero son generalmente obtenidas con tubos de vidrio normal sin anticoagulantes que permite la formación de coágulos de sangre después de que el suero es recolectado, y, posteriormente, pasado a un nuevo microtubo para su transporte.

 Si no es posible realizar la extracción en los tres días siguientes a su obtención, el plasma y el suero deberían ser congelados preferiblemente a -80ºC o al menos a -20ºC.

 Buffy coat es una fracción enriquecida en leucocitos a partir de sangre total. Preparar esta fracción a partir de sangre total es simple y tiene un rendimiento aproximadamente de 5-10 veces más de ADN que un volumen equivalente de sangre total. Su preparación se realiza por centrifugación de la sangre a 2500 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se observan 3 fracciones. La fracción superior es el plasma; la intermedia es el byffy coat que contiene los leucocitos concentrados; y la fracción inferior contiene los eritrocitos.

  3.2 Preparaciones preliminares  

Disolver la proteinasa K en 1,3 ml (50 extracciones) o en 2 x 3,35 ml (250 extracciones) en agua libre de nucleasas y conservar a –20ºC. Se recomienda realizar varias alícuotas para evitar demasiados ciclos de descongelado-congelado. A esta temperatura es estable durante 1 año. 

 Verificar que el Tampón de Lisis/ Unión no tienen precipitados debido a las bajas temperaturas. Si es necesario, disolver los precipitados calentando la solución a 37ºC. 

Añadir el Etanol 100 % indicado en la etiqueta al Tampón de Desinhibición, unos 10 ml (kit 50 extracciones) y unos 50 ml (kit 250 extracciones) .

Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol. 

Añadir el Etanol 100 % indicado en la etiqueta al Tampón de Lavado, unos 40 ml (kit 50 extracciones) y unos 200 ml (kit 250 extracciones) .

Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol. 

Pre-calentar el Tampón de Elución a 70ºC.

 Protocolo para la extracción de ADN genómico a partir de los linfocitos de la sangre

Este protocolo es para la purificación del ADN genómico a partir de los linfocitos realizando para ello una lisis selectiva de los eritrocitos con el Tampón de Lisis RBC. 

Este, también es un método ideal, si se requiere sólo el ADN genómico o mitocondrial, ya que produce unos resultados mejores en cuanto a calidad y rendimiento. 

 ( PRETRATAMIENTO )

1. Pipetear 300 micro litros de sangre en un microtubo de 1,5 ml. Añadir 900 microlitros de Tampón Lisis RBC. Mezclar con agitador tipo vórtex e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

2. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. Eliminar el sobrenadante por decantación mejor que con micropipeta, ya que se puede aspirar el pequeño pellet celular no visible, y dejar 10-20 microlitros de líquido residual. Agitar con agitador tipo vórtex el microtubo para resuspender el pellet. 

       

                   


(EXTRACCION) 
                   

3. Añadir 180 microlitros de Tampón de lisis de Tejidos y 25 microlitros Proteinasa K. Mezclar con agitador tipo vórtex durante 2-5 segundos. 

4. Incubar a 56ºC durante 10 minutos.

5. Añadir 200 microlitros de Tampón de Lisis / Unión. Mezclar con agitador tipo vórtex. Incubar a 70ºC durante 10 minutos. 

PURIFICACION

A.- PRECIPITACION

6. Añadir 200 microlitros de Etanol (96-100%) al lisado. Mezclar agitador tipo vórtex. 

7. Pasar la muestra a una MicroSpin columna con su tubo de recolección. 

8. Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el tubo de recolección. Si la muestra no ha pasado completamente, repetir el paso de centrifugación.

 9. Colocar la MicroSpin columna en un nuevo tubo de recolección y añadir 500 microlitros de Tampón de Desinhibición en el reservorio de la Spin columna. Centrifugar a 12.000-14.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.

B.- LAVADO

10. Añadir 500 microlitros de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna. Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido. 

11. 2º Lavado. Añadir 500 microlitros de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna. Centrifugar a 14.000 rpm durante 60 segundos. Eliminar el líquido.

C.- RESUSPENSION

 12. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar el etanol residual. 

13. Eliminar el tubo de recogida y insertar la spin columna en un microtubo de 1,5 ml.

 Añadir 50- 20 0microlitros de Tampón de elución (precalentado a 70ºC) en el reservorio de la Spin columna. Incubar 1 minuto.

14. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. El microtubo contiene ahora el ADN genómico.