DANAGENE SALIVA KIT PROTOCOLO RÁPIDO

DANAGENE SALIVA KIT PROTOCOLO RÁPIDO


 Extracción a partir de muestras de 600 microlitros de saliva directa


Componentes kit 
                                    Ref.0603.4                                                Ref.0603.41          Conservación                                          50  extracciones                                          160 extracciones

Tampón de Lisis            30 ml                                                        3 x 34,5 ml           Tª ambiente Tampón                          10 ml                                                         3 x 14 ml              Tª ambiente
Precipitación proteínas                                                                    3x  37,5 ml          Tª ambiente
Tampón de Hidratación  35 ml                                                                                                                                                                   

           
SOLUCION MUCULOTICA Y DESCONTAMINANTE PARA ESPUTOS

N-acetil-L-cisterna (NALC): 0,375 g. 

Citrato trisódico .2 H2O: 14,5 g. 

Hidróxido sódico (NaOH): 20,0 g. 

Agua destilada: hasta 1000 ml 

NOTA: Si la Solución de Lisis contiene un precipitado debido a las bajas temperaturas, incubar a 37ºC y mezclar para disolver el precipitado.

Equipos y reactivos necesarios y no provistos

 - Isopropanol. - Etanol 70%.

 - Microtubos de 1,5 o 2 ml

. - Centrifuga de alta velocidad

. - Agitador tipo vórtex. 

- Micropipeta y puntas.

 - Baño de agua.

PRETRATAMIENTO

Toma de muestra 

Depositar aproximadamente unos 1,5 ml de saliva en un envase de recogida. Se recomienda no haber comido nada durante los 30 minutos previos a la toma de muestra. Para ello pasar la lengua con movimientos arriba-abajo por las paredes de las mejillas, mandíbulas y paladar para recoger las células.

Lisis Celular 

1. Colocar 600-800 micro litros saliva en un microtubo de 1.5 ml. Centrifugar durante 90 segundos a 13.000-16.000 x g. Eliminar el sobrenadante con pipeta sin dañar el pellet blanco visible de células.

EXTRACCION

2. Añadir 600 micro l. de Tampón de Lisis. Resuspender con la micropipeta mediante movimientos arriba y abajo, para disolver el pellet de células y lisarlo. MUY IMPORTANTE, resuspender completamente el pellet sin que se observe ningún grumo blanco, ya que sino la cantidad de ADN obtenida será pequeña.

 3. Incubar durante 10 minutos. Agitar los tubos suavemente cada 2 minutos. Si es posible incubar a 37ºC, ya que esto mejorará el rendimiento.

PURIFICACION

Precipitación proteica. 

1. Añadir 200 micro l. de Tampón de Precipitación proteínas al lisado celular. 

2. Mezclar vigorosamente con un agitador tipo vórtex, a máxima velocidad durante 20-30 segundos. 

3. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 5 minutos. Se formará un precipitado. Si se observan partículas flotando volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo

Precipitación del ADN. 

1. Traspasar el sobrenadante que contiene el ADN a un microtubo de 1,5 ml que contenga 600 micro l de Isopropanol.

 2. Mezclar por inversión unas 25-50 veces.

 3. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 2 minutos. El ADN será visible como un pellet blanco.

 4. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 600 micro l de Etanol 70% para lavar el ADN.

 5. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante sin tocar el pellet de ADN. Volver a centrifugar brevemente y con una micropipeta y punta fina recoger las últimas gotas el etanol residual.

 6. Invertir el microtubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 5-10 minutos. 

Hidratación del ADN.

 1. Añadir 100-750 micro l. Tampón de Hidratación, dependiendo del tamaño del pellet de ADN, y resuspender con micropipeta.

 Es posible que los pellets de gran tamaño necesiten una incubación a 55ºC durante 1 hora para poder resuspenderlos completamente antes de llevar a cabo la PCR. Para pellets muy pequeños se puede utilizar 25-50 micro l. de Tampón de Hidratación.

 2. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o – 80ºC.