BIOLOGIA Y CULTIVO DE CÉLULAS EUCARIOTAS
1. OBJETIVO DEL EXPERIMENTO
El objetivo de este experimento es familiarizar a los estudiantes con un sistema de cultivo celular sencillo y fiable. Los estudiantes serán introducidos en los principios básicos del cultivo celular y utilizarán la técnica estéril para examinar el crecimiento celular y la viabilidad de las células de insecto Sf9.
2. MATERIAL Y REACTIVOS
Componentes CONSERVACIÓN A.
Células de insecto (Sf9). Tª ambiente B.
Medio de cultivo de las células de insecto. Nevera (4ºC) C
. Medio para la práctica de técnica estéril. Nevera (4ºC) D.
Colorante azul tripán. Tª ambiente E.
Tampón Fosfato Salino (PBS 1x). Tª ambiente F.
Colorante Giemsa. Tª ambiente
Frasco cultivo celular (estéril, 25 cm2 ) (T-25). T ambiente
Tª ambiente Placas de cultivo celular (estéril, 60 mm). T ambiente
Cámaras de recuento celular. T ambiente
Pipetas grandes de transferencia (estériles). T ambiente
Pipetas pequeñas de transferencia. T ambiente
Pipetas de 10 y 25 ml (estériles). T ambiente
Tubos de fondo cónico de 15 ml. T ambiente
Tubos de fondo cónico de 50 ml. T ambiente
Tubo de centrifuga de 1,5 ml T ambiente
NOTA: Las células de insecto Sf9 se deben solicitar 2 semanas antes de comenzar el experimento. Las células de insecto se han de cultivar inmediatamente después de su recepción.
NOTA: El Medio de cultivo de las células de insecto y el Medio para la práctica de técnica estéril se deben almacenar inmediatamente en nevera (4°C) después de su recepción. Todos los componentes de esta práctica están destinados únicamente a la investigación educativa. No deben usarse para fines diagnósticos o farmacológicos, ni para ser administrados o consumidos por seres humanos o animales.
2.1 Material necesario y no incluido en este kit
Recipiente grande con cubierta de plástico o caja de cartón con tapa, para su uso como cámara de incubación (la caja EDVOTEK pueden utilizarse para hacer crecer los cultivos).
Etanol 70% en botellas de aerosol.
Metanol.
Pipeta con pera de succión o pipeta automática.
Microscopio de contraste de fase invertida / campo brillante (las células se pueden ver con un microscopio de estudiante en posición vertical).
Micropipeta de 10-1000 µl y puntas.
Rotuladores marcadores.
Gafas de seguridad, mascarilla (opcional), guantes de laboratorio desechables y batas de laboratorio. Contenedores de residuos (vaso de precipitado).
NOTA: El frasco para el cultivo celular utilizado en esta práctica tiene aproximadamente 2,5 cm de altura.
Deben asegurarse que hay suficiente espacio entre el portaobjetos y los objetivos para ver las células.
3. INTRODUCCIÓN
El cultivo de células eucarióticas El cultivo celular, la capacidad de crecer y estudiar bacterias, virus y células eucariotas, es una piedra angular de la biología moderna. En experimentos de cultivos celulares, los científicos recrean el ambiente natural de las células en un laboratorio para responder a importantes preguntas biológicas. Esto puede incluir estudios que examinen la estructura, el comportamiento o la enfermedad de las células.
El cultivo celular ha aumentado la comprensión de las funciones celulares y se ha convertido en una plataforma importante para el estudio tanto del desarrollo normal como de las enfermedades de las células. Aunque los científicos realizaron los primeros experimentos de cultivo celular a mediados de 1800, las técnicas no se desarrollaron realmente hasta el siglo XX. Desde entonces, el cultivo celular ha permitido que células de docenas de especies sean cultivadas y estudiadas. Uno de los primeros de estos experimentos implicó preparaciones brutas de tejidos que se colocaron en una solución tampón. Muchos de los ensayos iniciales de cultivos celulares no tuvieron éxito, e incluso los estudios más prometedores sólo pudieron mantener las células vivas durante unos días.
Afortunadamente, mediante el uso de reactivos y técnicas mejoradas, ahora es posible cultivar células durante meses, años e incluso décadas. Se han seleccionado muchas células cultivadas para mutaciones que les permiten crecer en cultivo indefinidamente, produciendo las llamadas "líneas celulares inmortalizadas".
El cultivo celular ha dado lugar a avances en los campos de la ciencia de la vida, la biotecnología y la investigación farmacéutica. Por ejemplo, la investigación inicial de vacunas dependió en gran medida del uso de animales para pruebas y producción de virus. Sin embargo, el desarrollo de cepas de cultivo celular ha permitido la transición fuera de animales vivos. Además de reducir las pruebas en animales, el cultivo celular ha aumentado la reproducibilidad y reducido los costos asociados con la producción de vacunas.
El cultivo celular también se usa para estudiar muchas enfermedades comunes, incluyendo trastornos genéticos, infecciones virales y bacterianas y cáncer. Estos experimentos pueden examinar las células sanas y enfermas, monitorear los efectos de las adiciones o supresión de genes o detectar terapias eficaces.
El cultivo de células de insectos Sf9 El cultivo de células de insectos se originó como un enfoque para comprender mejor la biología de los insectos. Muchos de los primeros estudios con células de insectos fueron diseñados para analizar cuestiones biológicas básicas.
Estos experimentos proporcionaron información valiosa sobre el desarrollo y la patología de los insectos. Además, se ha utilizado el cultivo de células de insectos para desarrollar nuevos insecticidas y otros elementos disuasivos contra las plagas agrícolas.
Una de las más populares de estas cepas de insectos ha sido la línea celular Sf9, que se derivó de las células ováricas de la gusano común de la caída, Spodoptera frugiperda (palomilla del maíz)
(Figura 1)
(Figura 2)
. Estos rasgos simplifican las condiciones de crecimiento y reducen el costo de cultivar las células. La facilidad de crecimiento de las células Sf9 las ha convertido en una parte esencial de la industria biotecnológica, donde las células se utilizan comúnmente en la producción de proteínas y virus recombinantes. Es importante destacar que la sencillez de la cultura también hace de las células de insectos un sistema modelo útil para el aula.
Técnicas de cultivo celular
Se han desarrollado muchas herramientas y técnicas para mantener células cultivadas. Por ejemplo, los investigadores utilizan frascos estériles y placas que han sido tratadas para permitir que las células adherentes se adhieran y crezcan. La mayoría de las líneas celulares no humanas son no patógenas y pueden cultivarse en campanas de cultivo simples. Estas campanas ayudan a prevenir la contaminación de las células por bacterias, hongos, levaduras y moho, pero no están diseñadas para proteger al científico.
(Figura 3).
Por el contrario, las células infecciosas y los virus pueden requerir niveles elevados de equipo de protección personal, campanas de cultivo específicas e incluso salas e instalaciones especializadas. Las condiciones estériles se mantienen descontaminando todas las superficies y equipos con etanol, y usando pipetas "de barrera" que contienen un filtro. Las células se cultivan en medio de crecimiento, una solución químicamente compleja que proporciona los nutrientes necesarios para que las células crezcan. Los medios contienen típicamente aminoácidos esenciales, tampones, sales y una fuente de carbono como la glucosa. Esta mezcla se equilibra cuidadosamente para su uso con líneas celulares específicas y la elección de los medios es esencial para el crecimiento y el comportamiento adecuados. Además, muchas líneas celulares se suplementan con suero animal, para proporcionar factores esenciales de crecimiento, y antibióticos para ayudar a reducir las posibilidades de infección bacteriana. El medio celular de insectos proporcionado para esta práctica contiene suero y antibióticos, que se conoce como un "medio completo".
4.TECNICA
A) PREPARACION.
Esterilización de equipos y materiales
1. Esterilizar la poyata del laboratorio con una solución de lejía 10%, etanol 70% o cualquier otro desinfectante comercial para laboratorios.
2. Todos los materiales que entran en contacto con las células deben ser desinfectados antes de su eliminación, incluyendo placas y frascos de cultivo, pipetas, pipetas de transferencia y tubos.
Limpiamos con etanol 70%, la cabina, tanto por dentro como por fuera, colocamos todo el material necesario para realizar la tecnica dentro, ( pipetas varia medidas, permanente,tijeras,gradillas, aspirador automatico y manual, cubetas para colocar el material , y otra de rechazo,, cada una en su zona , todo el material del kit, y las alicuotas...tod ello desinfectado con etanol 70% ).
La utilización de batas de laboratorio y mascarillas son MUY RECOMENDADAS para minimizar el riesgo de contaminación de los cultivos celulares. Se debe mantener el pelo largo atado y hablar lo mínimo posible durante la manipulación de los cultivos celulares. 2. Se deben usar guantes desechables en todo momento.
ROCIAR los guantes desechables con etanol 70% y frotar ambos guantes para desinfectarlos. Esto se debe hacer con frecuencia mientras se trabaja con las células para evitar la contaminación. Cambiar los guantes según sea necesario e inmediatamente desinfecte el nuevo par con etanol 70%.
Preparación de las Cámaras de Incubación.
Es necesario preparar una cámara incubadora para contener las células. Las incubadoras deben mantenerse entre 24-27°C y la atmósfera estándar. Un gran recipiente de plástico o caja de cartón puede servir como una gran incubadora para toda la clase. Las células de insectos prefieren crecer en la oscuridad, por lo que los envases transparentes deben estar cubiertos con papel de aluminio.
NOTA: Se recomienda que las cámaras incubadoras se esterilicen limpiándolas con etanol 70% antes de iniciar el experimento.
Alicuotar el medio de cultivo de células de insectos
1. ALICUOTAR asépticamente 15 ml de Medio de cultivo para células (B) en seis tubos cónicos de 50 ml. Reserve el medio restante para iniciar el cultivo de células de insectos.
2. ETIQUETAR cada tubo como Medio de cultivo de las células de insecto.
3. ALMACENAR a 4 ° C hasta que se necesiten para la practica
PRETRATAMIENTO
B) TECNICA ESTERIL
1. SACAR el Medio para la práctica de técnica estéril de la nevera y dejar ATEMPERAR en la poyata durante 10 minutos.
2. ROCIAR el tubo de medio, pera de succión, y guantes con etanol 70% para desinfectarlos y preparar el área de trabajo con la técnica estéril.
3. Con cuidado, pero rápidamente, TRANSFERIR 3 ml de medio de la práctica de técnica estéril a una placa de cultivo celular de 35 mm.
NOTA: Se debe minimizar el tiempo que el medio y la placa están expuestos al ambiente para disminuir el riesgo de contaminación.
4. CUBRIR la placa y colocarla cuidadosamente en la cámara incubadora de cultivo celular preparada. INCUBAR la placa durante la noche.
5. RETIRAR TODAS las pipetas usadas y no usadas, frascos, y otros materiales del área de trabajo y limpiar la superficie de trabajo con etanol 70%.
6. VOLVER A GUARDAR todos los medios y soluciones de stock en el refrigerador.
NOTA:Nosotros utilizamos 2 ml de celulas mosquito , mas 2 ml de" comida".
7. Al día siguiente, RECUPERAR la placa de la incubadora y examinarla con un microscopio para comprobar que no hay contaminación. Los medios deben ser claros y de color amarillo claro.
https://www.youtube.com/watch?v=5-tutL4mzh0&list=TLPQMDExMjIwMTmapyEHkle-pg&index=1
La observacion se hace mediante el microscopio invertido
C) Mantenimiento del cultivo de las células de insectos
C.1. ALIMENTACIÓN DE LAS CÉLULAS DE INSECTOS.
Las células de insectos cultivadas requieren una fuente consistente de nutrientes para crecer y dividirse, los cuales se proporcionan en el medio de células de insectos. Con el tiempo, las células agotan los nutrientes y factores de crecimiento del medio. Además, los medios de cultivo acumulan productos de desecho tóxicos de las células. Las células dejadas en estas condiciones finalmente morirán, por lo que es importante cambiar regularmente los medios para mantener un cultivo sano. No olvidarse de seguir las técnicas asépticas (revisar el apartado de técnica aséptica básica).
1. RECUPERAR el tubo de Medio para las células de insecto de la nevera Se debe guardar a 4ºC al recibirse) y dejar que se atempere el medio a temperatura ambiente antes de usarlo.
2. RETIRAR 4 ml del medio del frasco con las células en cultivo utilizando una pipeta de transferencia estéril, tener cuidado de no agitar las células en la parte inferior del frasco.
NOTA: Para obtener un crecimiento óptimo, deje 1 ml del medio viejo en el frasco. Este medio contiene factores de crecimiento secretados por las células que son importantes para mantener la salud de las células.
3. DESECHAR el medio retirado del frasco en un recipiente de desecho (vaso de precipitado) asignado para este propósito que contenga unos pocos ml de lejía 10%.
4. AÑADIR 4 ml de medio para células de insecto fresco usando una pipa de transferencia estéril nueva.
5. VOLVER a depositar el frasco con las células de insecto en la cámara de incubación durante 2-4 días antes de continuar .
NOTA: Recordar que se deben revisar las células de los insectos con frecuencia para controlar el estado de salud del cultivo
C.1,1 SUBCULTIVOS DE LAS CÉLULAS DE INSECTOS
Cuando se alimentan adecuadamente con el medio de células de insecto, las células crecen y se multiplican en la superficie del frasco hasta alcanzar una confluencia del 100%. En este punto, las células dejarán de dividirse porque no hay más espacio para propagarse, lo que se conoce como inhibición de contacto. Si se deja en esta condición durante demasiado tiempo, las células perderán la salud y morirán. En cambio, una vez que las células han alcanzado la fase logarítmica tardía del crecimiento y tienen un confluente de 70-80%, es el momento de subcultivar las células en frascos nuevos.
6. GOLPEAR suavemente la parte inferior del frasco contra la palma de su mano para sacudir las células sueltas.
7. Usando una pipeta estéril de 10 ml y una pera de succión para la pipeta, PIPETEAR la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo varias veces para separar las células restantes. Pipetear hacia arriba y hacia abajo también para dispersar las células en una única suspensión de células (eliminando los agregados celulares), para facilitar un crecimiento uniforme en las placas siguientes. NOTA: Usar suficiente fuerza para separar las células del frasco pero evitando burbujas o espuma en el medio.
8. Utilizar un microscopio para CONFIRMAR el desprendimiento de las células de insecto de la parte inferior del frasco.
9. COGER dos placas de cultivo celular de 35 mm nuevas y etiquetar ambas con las iniciales de los estudiantes (o la identificación del grupo). Etiquetar una placa "Módulo IV" y la otra placa "Módulo V".
10. Utilizar una pipeta de transferencia estéril para AÑADIR 1 ml de Medio para las células de insecto en cada placa.
11. Utilizando la misma pipeta, TRANSFERIR 1 ml de la suspensión de células de insecto en cada placa de 35 mm.
12. Suavemente mover las placas hacia adelante y hacia atrás para DISTRIBUIR las células uniformemente. Esto representa una dilución 1:5 de las células en cada uno de los frascos nuevos.
13. EXAMINAR las células bajo el microscopio. CONFIRMAR que tiene células en sus placas y que sus células son redondas y claras, no marchitas y oscuras. NOTA: En este punto, el frasco puede ser devuelto a la cámara de incubación y controlado para el crecimiento continuo. Alternativamente, las células pueden terminarse añadiendo 1 ml de lejía e incubando el cultivo durante 1 hora antes de desechar.
14. ANOTAR los datos necesarios en el registro de datos de cultivo celular.
15. Después de 24 horas, las células de insecto deberían haberse unido a la superficie del frasco y las placas.
CONFIRMAR la fijación de las células bajo el microscopio.
D ). Ensayos de Viabilidad de las Células utilizando colorante Azul Tripán
La cámara de recuento de células, o "hemocitómetro", es un dispositivo ampliamente utilizado para contar las células en un volumen específico de fluido. En este caso concreto, la cámara también se utilizará para diferenciar las células muertas de las vivas. Las células vivas y viables excluyen el colorante azul tripán mientras que las células muertas captan el colorante y se tiñen de color azul. Las células se contarán diariamente durante varios días seguidos (hasta una semana) para determinar la tasa de crecimiento y la viabilidad del cultivo.
D.1 CONTAR LAS CÉLULAS VIVAS Y MUERTAS
1. RECUPERAR su placa de cultivo celular "Module IV" de la cámara de incubación. Anotar la confluencia en el registro de datos del cultivo celular.
. 3. Utilizando una pipeta de volumen ajustable, TRANSFERIR 10 μl de suspensión celular en un tubo de microcentrífuga. VOLVER a depositar la placa de las células en la incubadora.
NOTA: Es importante mantener la placa de las células estéril. No olvidarse de seguir las técnicas asépticas
4. AÑADIR 10 μl de colorante azul tripán a las células del tubo de microcentrifuga y suavemente mezclar golpeando suavemente el tubo o pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Esta es una dilución de 2 veces de las células
6. TRANSFERIR lentamente 20 μl (aproximadamente una gota) de suspensión de células teñidas de azul tripán a una muesca en el lado inferior izquierdo de un área de recuento de la cámara de recuento de células. La cámara se llenará por acción capilar.
7. EXAMINAR la cámara de recuento en el microscopio usando el objetivo más bajo.
8. ENFOCAR las líneas de la rejilla en la cámara. Mueva el portaobjetos hasta que el campo que vea sea la rejilla externa - esto también podría requerir el cambio a un objetivo de mayor potencia.
NOTA: El área de la rejilla es de 3 mm x 3 mm, mientras que cada cuadrícula pequeña (área no dividida por ninguna línea adicional) es 0,33 mm x 0,33 mm.
9. CONTAR todas las células (vivas y muertas) dentro de cada una de las cuadrículas pequeñas
ANOTAR el número de células viables (claras y brillantes) y no viables (azul profundo) en el registro de datos del cultivo celula
10. GUARDAR el hemocitómetro a temperatura ambiente hasta que sea necesario para el siguiente recuento de células del experimento.
NOTA: ¡No intente limpiar las células fuera del pocillo usado!
E) Ensayo de tinción diferencial utilizando colorante de Giemsa
Las células se tratan comúnmente con colorante para teñir las características de la célula, haciendo posible distinguir hasta los detalles más pequeños. El colorante de Giemsa, una mezcla de azul de metileno y eosina, tiñe la membrana y el núcleo azul y el citoplasma azul claro o morado. Este Módulo debe realizarse cuando las células en la placa cuando tienen al menos 70% de confluencia, normalmente 3-4 días después de depositar las células en el frasco
OBSERVAR LAS CÉLULAS TEÑIDAS BAJO EL MICROSCOPIO
1. RECUPERAR la placa de células del “Módulo V” de la incubadora y observar las células usando un microscopio. Las células deben estar sanas y unidas a la placa.
NOTA: Para este procedimiento, no hay necesidad de una técnica aséptica, pero es importante seguir trabajando con las prácticas estándar de seguridad en el laboratorio.
2. DESECHAR el medio de cultivo de la placa en un contenedor de residuos.
3. AÑADIR 2 ml de PBS y mueva suavemente la placa para lavar las células.
4. DESECHAR el PBS de la placa en un contenedor de residuos.
5. Utilizando una pipeta de transferencia, AÑADIR suavemente 2 ml de metanol enfriado (helado) a la placa y mueva suavemente la placa para cubrir toda la superficie.
6. TAPAR la placa e INCUBAR las células para fijarlas durante 10 minutos a temperatura ambiente.
7. DESECHAR el metanol en un contenedor de residuos.
8. SECAR las células, quitando la tapa de la placa, durante 5 minutos en la poyata del laboratorio.
9. Para teñir las células, AÑADIR 1 ml de colorante Giemsa en la placa y mover suavemente la placa para cubrir las células.
10. INCUBAR la placa durante exactamente 30 segundos y luego DESECHAR el colorante Giemsa en un contenedor de residuos.
NOTA: Es posible sobreteñir las células si el colorante Giemsa se deja más de 30 segundos.
11. AÑADIR 2 ml de PBS a la placa e INCUBAR durante 5 minutos.
12. DESECHAR el PBS de la placa en un contenedor de residuos.
13. LAVAR la placa dos veces con 2 ml de agua del grifo. DESECHAR el agua e inmediatamente transferir la placa a un microscopio.
14. Usando un microscopio de campo brillante, EXAMINAR la morfología de las células mientras todavía están húmedas. Observar la tinción diferencial del núcleo y el citoplasma. Dibujar una imagen representativa de las células en su cuaderno de laboratorio, tomando nota del color y la intensidad de la tinción.
OBJETIVO X 40
CONCLUSION
La realizacion de la tecnica no fue la correcta y a consecuencia de ello hubo colonias de hongos que hicieron que el recuento fuese infructuoso, a pesar de ello , los diferentes pasos, como el conocimiento de los materiales, asi como el uso de la cabina y el trabajo en equipo han sido las notas mas importantes, a medida que avanzamos en la tecnica fuims cogiendo mas manejo y soltura y eso se noto en la tincion con el colorante Giemsa, ya que fue una de las mejores preparaciones que se obtuvo,, primer contacto con el laboratorio, siempre sumando....
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